Набор для окраски мазков на малярия

Паразитологическая диагностика малярии

1. Область применения и нормативные ссылки

1. Область применения и нормативные ссылки

2. Общие положения

3. Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците — так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита. Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в «тонком мазке» крови. Трофозоиты — одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты — делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется — кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии — образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы — образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит — округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер — образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale — 48 ч, Р. malariae — 72 ч. В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент — продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития. У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты — женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) — Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

4. Принцип метода паразитологической диагностики малярии

5. Необходимые реактивы и оборудование

Дефекты методики окрашивания препаратов крови по Романовскому-Гимза и их устранение

Внешний вид препарата

Вид окрашенных элементов крови и паразитов при микроскопировании

Меры предупреждения и исправления дефектов

Кислая реакция краски

Препарат макроскопически розового цвета

«Тонкий мазок» — эритроциты ярко-розовые, специфическая зернистость не выявляется, паразиты плохо различимы, ядра лейкоцитов и паразитов окрашены слабо, цитоплазма паразитов имеет розовый оттенок.

Проверить рН буферного раствора.

Препараты перекрасить после предварительного обесцвечивания.

Свежеприготовленные препараты — погрузить в дистиллированную воду, при сильном перекрашивании в воду добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты (1 — 2 капли на 50 мл воды). Ранее приготовленные препараты — смочить ватный тампон смесью Никифорова, 1 — 2 раза осторожно провести по препарату. Сразу после обработки результат проконтролировать под сухой системой микроскопа (окуляр х 7, объектив х 40), в случае необходимости обработку повторить. Необходимо иметь в виду, что улучшить качество окраски возможно преимущественно в случае «тонкого мазка». «Толстые капли» плохо поддаются переокраске. При повторной окраске время окрашивания должно быть сокращено

«Толстая капля» — не достигается полный гемолиз эритроцитов. Интенсивно розовый фон. Ядра паразитов сливаются с цитоплазмой

Избыточно-щелочная реакция краски

Препарат макроскопически синего цвета без фиолетового оттенка

«Тонкий мазок» — эритроциты голубые или синие, зернистость пораженных эритроцитов выявляется с трудом. Ядра лейкоцитов и паразитов окрашены в синий цвет и с трудом отличимы от цитоплазмы.

Проверить рН буферного раствора или качество отмывки предметных стекол от щелочи; заведомо щелочные стекла (синего цвета) не использовать. В случае необходимости попытаться перекрасить препарат (см. меры предупреждения и исправления дефектов)

«Толстая капля» — все элементы имеют синюю окраску. Ядро и цитоплазма паразита дифференцируется с трудом

Недостаток азура в краске Романовского

Препарат макроскопически синего цвета

Азурофильные элементы окрашены плохо; отсутствует характерный фиолетово-красный цвет ядер паразитов и лейкоцитов, а также специфической зернистости пораженных эритроцитов

В рабочий раствор добавить синьку Мансона. Препараты дополнительно докрасить (см. меры предупреждения и исправления дефектов)

Препарат макроскопически бледный

Форменные элементы крови, их структуры и все структуры паразита бледные. Паразиты выявляются с трудом только по пигменту.

Докрасить «тонкий мазок» в течение 20 — 30 мин, толстую каплю в течение 10 — 15 мин

В «тонком мазке» специфическая зернистость эритроцитов плохо прокрашена или не прокрашена

Препарат макроскопически темно-фиолетовый

«Тонкий мазок» — ядра лейкоцитов чернильного цвета, бесструктурные, ядра паразитов часто неотличимы от темно окрашенной цитоплазмы.

В случае необходимости перекрасить препараты (см. меры предупреждения и исправления дефектов)

«Толстая капля» — паразиты становятся похожи на обломки ядер лейкоцитов

Аутофиксированная «толстая капля»

Препарат макроскопически имеет металлический оттенок

Гемолиз в процессе окраски не достигается.

Этот дефект неустраним. Для предупреждения следует:

Микроскопия таких препаратов практически невозможна. Плотный фон состоит из многослойно расположенных эритроцитов

1. Окрашивать свежеприготовленные «толстые капли»;

2. Исключить возможность аутофиксации «толстых капель» (см. п. 6.4.1)

Plasmodium vivax в «тонком мазке» крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови

Стадии развития бесполых форм (продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 часов)

Половые формы (гаметоциты)

Все формы эритроцитарной шизогонии. Интенсивность паразитемии редко превышает 20 тыс. паразитов в 1 мкл крови. При нарастании паразитемии синхронность утрачивается, характерен полиморфизм — одновременное наличие разных стадий бесполых форм и гаметоцитов. Встречается поражение одного эритроцита несколькими паразитами, но реже и в меньшей степени, чем при P. falciparum

Занимает 1/6, более взрослый — 1/4 эритроцита, форма правильная или несколько вытянутая. Ядро округлое, реже несколько вытянутое, относительно плотное. Вакуоль хорошо выражена. Цитоплазма часто с утолщением в одном из участков. Пигмент — отдельные нежные зерна, темно-коричневого цвета в разных участках цитоплазмы

Молодые занимают 1/3 — 1/2 эритроцита, более зрелые — значительную его часть. Цитоплазма разнообразной формы с псевдоподиями, отражающими присущую этим стадиям амебовидную активность — т.н. амебовидные трофозоиты. Ядро округлое или овальное, крупнее и менее плотное в сравнении с кольцевидными трофозоитами, расположено периферически. Наиболее молодые имеют несколько длинных тонких псевдоподий, количественно увеличивающиеся по мере роста, придавая паразиту причудливую форму. Вакуоль относительно крупная, встречается т.н. добавочная вакуоль — слияние концов 2-х псевдоподий при приготовлении и последующей фиксации мазка крови. Пигмент темно-коричневого цвета, расположен чаще диффузно в цитоплазме, иногда концентрируется вокруг вакуоли или по периферии паразита. По мере роста паразита вакуоль постепенно уменьшается, псевдоподии сглаживаются

Занимает значительную часть эритроцита округлой или овальной формы без псевдоподий и вакуоли, с относительно правильным очертанием. Ядро относительно крупное, рыхлое, чаще несколько вытянутое, иногда дугообразное. Цитоплазма занимает основную часть клетки. Пигмент хорошо выражен, наряду с диффузным расположением, концентрируется по периферии паразита. Может начинать группироваться в отдельные скопления

Занимает значительную часть эритроцита. В неразделившейся цитоплазме от 2 до 18 — 20 (в среднем 14 — 16) ядер, уменьшающихся в размере. По мере деления ядер пигмент концентрируется в отдельные скопления

Занимает почти весь или весь эритроцит. 18 — 20 (в среднем 14 — 16) относительно мелких мерозоитов, расположенных асимметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление. Мерозоит округлой или овальной формы не свыше 2 ЦК в диаметре, ядро мелкое и плотное, расположено центрально или симметрично

Округлый или овальный, занимает весь пораженный эритроцит. Ядро относительно плотное, округлое или вытянутое, расположено асимметрично, реже в центре клетки. Цитоплазма окрашена в более интенсивный сине-голубой цвет в сравнении с бесполыми формами, вакуоли нет. Иногда вокруг ядра — зона просветления розоватого тона или даже почти бесцветная — менее интенсивное скопление хроматина по периферии ядра. Размер ядра варьирует. Пигмент — обильный, мелкие интенсивно окрашенные гранулы или грубые зерна, рассеянные по цитоплазме. Иногда трудно дифференцировать со взрослыми трофозоитами

Несколько уступает в размерах женскому гаметоциту. Ядро крупное, рыхлое с просветлениями, без четких границ, иногда различимо с трудом. Имеет более светлую и яркую окраску в сравнении с женским гаметоцитом. Цитоплазма бледно-голубого или серого цвета, иногда с розовым оттенком. Пигмент — мелкие обильные гранулы или грубые зерна яркой коричневой окраски, рассеяны по цитоплазме с тенденцией к концентрации вокруг ядра

Начиная со стадии развивающегося трофозоита и гаметоцита, паразит превышает размеры эритроцита. Изредка могут встречаться кольца с двойным ядром (см. таблицу «Р falciparum «) и напоминающие лентовидные формы (см.таблицу «P. malariae»)

Plasmodium falciparum в «тонком мазке» крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови

В распознавании малярии важное значение имеют данные эпидемиологического анамнеза (уровень эндемии и сезон передачи возбудителей в данной местности, возникновение болезни на протяжении 3 лет после пребывания в эндемическом очаге или на протяжении 3 мес после гемотрансфузии или внутривенных инфузий и др.) и выявление характерных клинико-лабораторных признаков (высокая и часто приступообразная лихорадка, сплено- и гепатомегалия, анемия и панцитопения).

Решающее значение в диагностике болезни имеет обнаружение плазмодиев в препаратах крови — толстой капле и мазке. Исследование крови на малярию проводят при первом подозрении на эту болезнь, независимо от температуры тела в момент забора крови.

Для паразитологического исследования используют капиллярную кровь, взятую из пальца, или венозную кровь. Микроскопию препаратов крови, окрашенных по Романовскому-Giemsa, проводят с использованием иммерсионной системы (окуляр 7х, объектив 90х). В каждом препарате изучают не менее 100 полей зрения (0,25 мкл крови), даже в тех случаях когда паразиты выявляются при исследовании меньшей площади препарата, что способствует более четкому изучению эритроцитарных стадий паразитов и выявлению случаев mixt-инвазии.

Ввиду большого объема крови, изучаемого в толстой капли крови, ее исследование позволяет быстрее обнаружить малярийные паразиты и определить интенсивность паразитемии. Изучение мазка крови помогает более точно определить видовую принадлежность паразитов и стадии их эритроцитарного развития. При определении вида возбудителя используют морфологические признаки плазмодиев и пораженных эритроцитов.

Важное клиническое значение имеет не только видовая характеристика возбудителя, но и определение стадий их развития и численности паразитов. Это особенно актуально для диагностики P. falciparum-малярии, при которой наличие в крови зрелых трофозоитов и шизонтов, а также большая интенсивность паразитемии являются прогностически неблагоприятными. Интенсивность паразитемии в толстой капли крови определяют по числу паразитов в поле зрения: 1-100 плазмодиев в 10 полях зрения соответствуют 5-50 паразитам в 1 мкл крови (+); 10-100 плазмодиев в 10 полях зрения— 50-500 паразитов в 1 мкл крови (++); 1-10 плазмодиев в 1 поле зрения — 500-5000 паразитов в 1 мкл крови (+++); 10-100 плазмодиев в 1 поле зрения — 5000-50 000 паразитов в 1 мкл крови (++++), более 100 паразитов в 1 поле зрения — более 50 000 паразитов в 1 мкл крови (+++++); а также по соотношению числа паразитов и лейкоцитов в препарате с последующим перерасчетом на число лейкоцитов в 1 мкл крови. Интенсивность паразитемии может быть вычислена и по количеству паразитов, приходящихся на 100 эритроцитов (в 10 полях зреня) При паразитемии P. falciparum более 100 000 плазмодиев в 1 мкл или поражении более 5% эритроцитов прогноз может быть неблагоприятным у 7-20% больных, а при паразитемии более 500 000 плазмодиев в 1 мкл крови или поражении 10% эритроцитов и более летальные исходы развиваются в 65% случаев. При Р. vivax-малярии редко поражается более 2% эритроцитов.

Ввиду возможности развития выраженных симптомов малярии при относительно невысоком уровне паразитемии (обычно у неиммунных лиц) однократный отрицательный результат микроскопии крови не исключает диагноз малярии, а делает необходимым повторное исследование препаратов крови, взятых через 8-12 ч.

У больных с паразитологически подтвержденным диагнозом малярии микроскопию препаратов крови проводят ежедневно, при тяжелых формах Р. falciparum-малярии дважды в день до исчезновения паразитов, а затем еженедельно до 28-го дня лечения для оценки эффективности терапии. При P. falciparum-малярии это позволяет своевременно выявлять резистентность плазмодиев к применяемому препарату.

Определенное диагностическое значение имеют выявляемые в гемограмме признаки анемии (анизопойкилоцитоз, ретикулоцитоз и др.), лейкопения и относительный лимфомоноцитоз.

Серодиагностика малярии включает использование НРИФ, РИФ, ИФА, РИГА и др. и имеет наибольшее значение в неэндемических районах. Обнаружение в НРИФ антител к P. falciparum в титре 1:80 и более свидетельствует о свежей инвазии.

Дифференциальный диагноз малярии проводят с гриппом и другими острыми респираторными вирусными инфекциями, острыми кишечными инфекциями, лептоспирозом, желтой лихорадкой, злокачественными формами вирусных гепатитов, тифо-паратифозными заболеваниями, бруцеллезом, сепсисом, геморрагическими лихорадками инфекциями мочевыделительной и гепатобилиарной систем, заболеваниями системы крови.

Малярия – это инфекционное заболевание, которое вызывает повторяющиеся приступы озноба и лихорадки. Возбудителем малярии является плазмодий – паразит, передающийся с укусами комаров – носителей инфекции. Каждый год от малярии умирает примерно один миллион людей по всему миру, но наиболее распространена она в странах с тропическим и субтропическим климатом.

Вакцины для предотвращения малярии не существует, однако при приеме профилактических средств риск заболеть снижается.

Успешность лечения зависит от вида плазмодия, состояния больного и других факторов.

Болотная лихорадка, перемежающаяся лихорадка, пароксизмальная малярия.

Malaria, Jungle fever, Marsh fever.

Для малярии характерно периодическое повторение приступов (каждые 48-72 часа, в зависимости от вида возбудителя). Приступ длится примерно 1-2 часа и сопровождается следующими симптомами:

• озноб – от умеренного до тяжелого,
• высокая температура тела (до 39-41 °С),
• кашель,
• обильное потоотделение (появляется в конце приступа и сопровождается снижением температуры до нормальной или ниже нормы).

Кроме того, могут появляться другие симптомы:

• головная боль,
• тошнота, рвота, понос,
• усталость, быстрая утомляемость,
• потеря аппетита,
• боль в мышцах,
• желтуха.

Как правило, малярия проявляется в течение нескольких недель после укуса зараженного комара. Однако некоторые паразиты могут находиться в организме несколько месяцев или лет, не вызывая никаких симптомов.

Общая информация о заболевании

Малярия – это инфекционное заболевание, которое вызывает повторяющиеся приступы озноба и лихорадки. Возбудителем являются четыре вида паразитов, передающихся с укусами комаров – носителей инфекции. Реже малярия распространяется через переливание крови или от матери к плоду. Чаще всего она встречается в странах с тропическим и субтропическим климатом.

Жизненный цикл малярийного паразита начинается, когда самка комара вида анофелес, питаясь кровью больного малярией, проглатывает паразитов. В процессе полового развития в организме комара из них развиваются спорозоиты (одна из жизненных форм паразита), располагающиеся в слюнных железах насекомого.

При укусе комар вводит слюну со спорозоитами в организм человека, где они размножаются бесполым путем в клетках печени. После периода созревания, длящегося от нескольких суток до нескольких месяцев, паразиты высвобождаются из клеток печени и проникают в эритроциты (красные кровяные тельца), что является началом активной фазы болезни. В эритроцитах происходит дальнейшее бесполое размножение паразитов; при разрыве оболочки эритроцита (каждые 48-72 часа) плазмодии оказываются в плазме крови, что обуславливает возникновение лихорадки и озноба. Затем они проникают в непораженные эритроциты и цикл повторяется. Промежуточные формы плазмодий способны сохраняться в организме (в печени) до нескольких лет, вызывая повторное развитие заболевания даже после курса лечения.

Малярия может привести к смерти, чаще всего от нее умирают дети в возрасте до 5 лет. Обычно летальный исход связан с осложнениями заболевания:

• церебральная малярия – зараженные эритроциты могут закупоривать мелкие кровеносные сосуды мозга, вызывая его отек или повреждение;
• дыхательная недостаточность из-за накопления в легких жидкости;
• повреждение органов – печеночная или почечная недостаточность, повреждение селезенки;
• тяжелая анемия как следствие уменьшения количества нормально функционирующих эритроцитов;
• низкий уровень сахара в крови (может быть спровоцирован как малярией, так и ее лечением).

Кто в группе риска?

Чаще всего малярией болеют люди, живущие в странах с тропическим и субтропическим климатом (африканские государства к югу от пустыни Сахары, индийский субконтинент, Соломоновы острова, Папуа-Новая Гвинея и Гаити), или гости этих стран.

Более тяжелому течению малярии подвержены:

• дети до 5 лет,
• туристы из регионов, где не распространено данное заболевание, посетившие субтропические или тропические страны,
• беременные и их еще не рождённые дети,
• бедные слои населения, не имеющие доступа к квалифицированной медицинской помощи.

Заподозрить заболевание позволяют периодические приступы лихорадки, особенно если пациент находился в очагах малярии за последние два года. Для подтверждения диагноза необходимо обнаружить паразита в мазках крови.

Лабораторные методы исследования

• Микроскопия мазка крови. Этот анализ до сих пор остается ведущим методом диагностики малярии. Он достаточно простой и недорогой, однако относительно трудоемкий. Кровь для приготовления мазка необходимо брать у пациента во время приступа лихорадки – это повышает вероятность обнаружения малярийных плазмодиев. После изготовления мазка и его окраски по специальной технологии можно обнаружить самих возбудителей заболевания или характерные изменения эритроцитов. В частности, при малярии в эритроцитах определяются пятна, обусловленные включениями плазмодиев. По результатам исследования мазка крови судят о наличии инфекции, а также определяют вид паразита и стадию заболевания.
• Определение антител к возбудителю малярии – молекул, вырабатываемых иммунной системой в ответ на попадание в организм малярийного плазмодия. Отрицательный результат анализа позволяет исключить диагноз «малярия».
• Определение белков возбудителя. Современный анализ, с помощью которого можно выявить в крови молекулы, входящие в состав малярийного плазмодия. Это быстрый, недорогой метод диагностики, обладающий высокой достоверностью в отношении малярийной инфекции.
• Определение генетического материала малярийного плазмодия методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Позволяет определить даже незначительное число возбудителей заболевания в крови. В силу высокой стоимости исследование широко не распространено.
• Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ).
  • Гемоглобин и эритроциты. Так как при приступах малярии происходит разрушение эритроцитов (гемолиз), их уровень в крови, а также уровень содержащегося в них гемоглобина может быть снижен, свидетельствуя о развитии анемии.
  • Тромбоциты. Снижение уровня тромбоцитов является характерным признаком малярии и наблюдается примерно у 70 % больных.
  • Лимфоциты. При малярии в крови могут определяться измененные (атипичные)лимфоциты (белые кровяные тельца).
  • Ретикулоциты – это созревающие эритроциты. Так как при приступах малярии зрелые эритроциты разрушаются, выработка ретикулоцитов возрастает.

• Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – фермент, который содержится во многих органах и тканях человека, в том числе в эритроцитах. Повышение ЛДГ является характерным признаком малярии.

• Аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ). Повышение уровня печеночных ферментов АЛТ и АСТ будет указывать на повреждение печени, вызванное малярией.

• Общий билирубин. Билирубин – конечный продукт распада гемоглобина. При усиленном разрушении эритроцитов его уровень повышается.

Другие методы исследования

• Компьютерная томография головного мозга. При признаках поражения центральной нервной системы может потребоваться выполнение компьютерной томографии головного мозга, которая позволяет выявить отек головного мозга и кровотечение в его оболочке.

Лечение малярии предполагает прием специальных противомалярийных препаратов, а также устранение осложнений заболевания.

Отмечается устойчивость некоторых видов малярии к лекарствам. Вакцины, позволяющей полностью избавить пациента от этого заболевания, не существует, хотя ее поиски активно ведутся.

• Применение противомалярийных препаратов при путешествиях в регионы с высоким уровнем заболеваемости малярией.
• Предотвращение заражения через укус. Избежать укусов комаров можно с помощью:
  • обработки стен дома специальными спреями,
  • использования москитной сетки, пропитанной препаратами против комаров,
  • ношения одежды, закрывающей тело, опрыскивания одежды противомоскитными спреями.

Рекомендуемые анализы

• Общий анализ крови
• Лактатдегидрогеназа
• Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
• Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
• Общий билирубин

Читайте также: